產品編號：MK1020
產品價格：1200元/盒（20T）
保存期：十二個月。-20℃冷凍保存。
工作原理：在機體內部隨時都在發生着細胞的死亡。傳統上用顯微鏡來觀察細胞的死亡，其特征為核染色質的濃縮及碎片的形成。但是這種現象出現的很晚，時間也很短暫。凋亡的特征是內源性核酸內切酶被激活，細胞自身的染色質或DNA 被切割，出現單鏈或雙鏈缺口，並產生與DNA 斷點數目相同的3’-OH 末端。末端脫氧核糖核酸轉移酶（Terminal deoxynucleotidyl Transferase ）可以將地高辛標記的dUTP （DIG-dUTP）標記至3’-OH 末端，DIG-dUTP 結合在DNA 斷點部位，可以通過生物標記的抗地高辛抗體（Anti-DIG-Biotin）反應后，再結合鏈酶親和素-過氧化物酶（SABC），然後加入顯色底物DAB 予以顯示。凋亡的細包核呈黃色，從而可以在顯微鏡下觀察到着色的凋亡細胞。
試劑盒內容：
1. 標記緩衝液(Labeling Buffer) 1ml
2. 末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT,×20) 20μι
3. DIG-dUTP (×20) 20μι
4. 封閉液(Blocking Reagent) 4ml
5. 生物素化抗地高辛抗體(× 100) 20μι
6. SABC (× 100) 20μι
7. Proteinase K (×200) 50μι
8． 抗體稀釋液4ml
陽性對照片2 張
用戶自備試劑：
1. 多聚賴氨酸或APES(博士德公司有售)。
2. 0.01M TBS,PH7.5(配法:1L 雙蒸餾水中加入8.5 克氯化鈉,1.2 克Tris 和0.45—0.5ml 純乙酸。)
3. DAB 顯色試劑盒（博士德公司有售)，也可自配顯色劑。
操作步驟：
1. 樣品處理
(1) 玻片預先用多聚賴氨酸或APES 進行處理。
(2) 細胞塗片和冰凍切片：最重要的是及時固定。用4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)室溫下固定30—60 分鐘。0.01M PBS 洗2 分鐘×2 次。蒸餾水洗滌2 分鐘×2 次。
(3) 組織：有條件時應及時固定。常規4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性緩衝福爾馬林固定4 小時以上，石蠟包埋。切片常規脫蠟入水（脫蠟務必乾淨）。
2. 新鮮配製3%H2O2，室溫處理10 分鐘。蒸餾水洗滌2 分鐘×3 次。
3. 標本片加0.01M TBS 1:200 新鮮稀釋Proteinase K 37℃消化1—15 分鐘,0.01M TBS 洗2 分鐘×3次。(細胞塗片和冰凍切片一般不消化或消化10—60 秒鐘。新鮮石蠟切片消化5-10 分鐘。陳舊石蠟切片消化10-15 分鐘)。
4. 標本片加標記緩衝液(Labeling Buffer) 20μι/片,以保持切片濕潤。按每張切片取TdT和DIG-d-UTP 各1μι，加入18μι標記緩衝液中，混勻。甩去切片上多餘液體后加標記液，20μι/片。置樣品于濕盒中，37℃標記2 小時。
5. 0.01M TBS 洗2 分鐘×3 次。
6. 加封閉液50μι/片，室溫30 分鐘，甩掉封閉液，不洗。
7. 用抗體稀釋液1：100稀釋生物素化抗地高辛抗體：（取1ml 抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10μι），混勻后50μι/片加至標本片上。置樣品于濕盒中，37℃反應30 分鐘。0.01M TBS洗2 分鐘×3 次。
8. 用抗體稀釋液1：100稀釋SABC：取1ml 抗體稀釋液加SABC 10μι，混勻后50μι/片加至切片。37℃反應30 分鐘。0.01M TBS 洗5 分鐘×4 次。
9. DAB 顯色：取1ml 蒸餾水，分別加入DAB 試劑盒中A，B，C 試劑各一滴，混勻后加至標本片上，顯色10-30 分鐘左右。水洗。
10. 甦木素輕度復染。0.01M TBS 洗，蒸餾水洗。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。
結果判定：
細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞。
注意事項：
1. 試劑盒嚴格-20℃存放。
2.初用時如試管底部無可見的試劑，在離心機離心5 分鐘，使試劑沉至管底。
3.檢測過程中切勿使樣品乾涸。
| 包裝︰ | 20T/KIT |
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