碧波Annexin V-EGFP細胞凋亡檢測試劑盒
一、產品簡介
Annexin是一類廣氾分布于真核細胞細胞漿內鈣離子依賴的磷酯結合蛋白，參與細胞內的信號轉導。Annexin V選擇性結合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細胞膜內側，即與細胞漿相鄰的一側。在細胞發生凋亡的早期，不同類型的細胞都會把磷酯酰絲氨酸外翻到細胞表面，即細胞膜外側。磷酯酰絲氨酸暴露到細胞表面后會促進凝血和炎症反應。而Annexin V和外翻到細胞表面的磷酯酰絲氨酸結合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎症反應活性。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。用帶有綠色熒光的熒光探針EGFP標記的Annexin V，即Annexin V-EGFP，就可以用流式細胞儀或熒光顯微鏡非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細胞凋亡的重要特征。與FITC的綠色熒光信號相比，EGFP的綠色熒光信號具有信號強，不易淬滅，穩定性高等優點。
Annexin V-EGFP細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit)是用EGFP標記的重組人Annexin V來檢測細胞凋亡時出現在細胞膜表面的磷酯酰絲氨酸的一種細胞凋亡檢測試劑盒。可以使用流式細胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設備進行檢測。
本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶可以染色坏死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞，呈現紅色熒光。對於坏死細胞，由於細胞膜的完整性已經喪失，Annexin V-EGFP可以進入到細胞漿內，與位於細胞膜內側的磷酯酰絲氨酸結合，從而也使坏死細胞呈現綠色熒光。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處於不同凋亡時期的細胞區分開來。
二、試劑盒組份
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組份
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Cat:BA1210
10 assays
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Cat:BA1220
20 assays
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Cat:BA1250
50 assays
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Cat:BA12100
100 assays
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儲存條件
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Annexin V-EGFP
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50μL
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100μL
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250μL
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500μL
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4℃避光
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結合液
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5.0 mL
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10 mL
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25 mL
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50 mL
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4℃
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碘化丙啶（PI）
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50μL
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100μL
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250μL
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500μL
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4℃避光
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三、試劑盒以外自備儀器和試劑
流式細胞儀或熒光顯微鏡、低速離心機、移液器
1.5m L離心管、載玻片、蓋玻片、PBS、不含EDTA的胰酶消化液
四、保存條件：
4℃保存，Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色液需避光保存，一年有效。為長期保存，可以把Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色液適當分裝后-20℃保存，Annexin V-EGFP結合液可以直接-20℃保存。
五、注意事項：
1、如果有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。
2、染色后宜儘快檢測，時間過長可能會導致凋亡或坏死細胞的數量增加。
3、熒光物質均易發生淬滅，在進行熒光觀察時，儘量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也儘量注意避光保存。
4、需自備PBS。
5、為了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。
6、本試劑盒適用於檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不以應低於1×105，，不適用於檢測組織樣本。
7、因檢測細胞的類型、凋亡誘導劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，因此建議每次檢測均需使用未經凋亡誘導處理的細胞作為對照，進行熒光補償的調節。
8、用流式細胞儀檢測，激發波長Ex=488 nm; 發射波長Em=530 nm。Annexin V-EGFP的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測；PI紅色熒光通過PI通道（FL2或FL3）檢測，建議使用FL3。熒光補償調節：使用未經凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調節去除光譜重疊和設定十字門的位置。
六、操作規程
1、對於懸浮細胞：
A、在進行完細胞凋亡刺激后，1000g (約1000-2000rpm) 離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞並計數。（注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細胞的作用，可以保証後續Annexin V-EGFP的結合。）
B、取1~5×105重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入500µl 結合液輕輕重懸細胞。
C、加入5µl Annexin V-EGFP，輕輕混勻；再加入5 μL 碘化丙啶，輕輕混勻。
D、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進行避光。
E、隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-EGFP為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用於熒光顯微鏡下檢測，滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，並用蓋玻片蓋上細胞即可檢測。
2、對於貼壁細胞：
A、把細胞培養液吸出至一合適離心管內，PBS洗滌貼壁細胞一次，用胰酶細胞消化液(最好不用含有EDTA)消化細胞。（注：胰酶消化時間不易過長，否則容易引起假陽性）
B、細胞消化下來后，加入步驟2A中收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到離心管內，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞並計數。。
C、取1~5×105重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入500µl結合液輕輕重懸細胞。
D、加入5µl Annexin V-EGFP，輕輕混勻；再加入5 μL 碘化丙啶，輕輕混勻。
E、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進行避光。
F、隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-EGFP為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用於熒光顯微鏡下檢測，滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，並用蓋玻片蓋上細胞即可檢測。
3、對於貼壁細胞的原位熒光顯微鏡檢測：
注：本方法的優點是可以原位觀察細胞凋亡，缺點是部分凋亡由於不貼壁而檢測不到。
A、(選做)如果條件許可，把細胞培養于24孔板、48孔板或96孔板內；或將細胞于蓋玻片上生長，用適當的凋亡誘導劑誘導細胞凋亡，並設立陰性對照組。
B、吸除細胞培養液，加入PBS洗滌兩次；或將蓋玻片用PBS洗滌兩次。
C、在500μL 的結合液中加入5μL Annexin V-EGFP， 5 μL碘化丙啶，輕輕混勻。
D、將上述溶液滴加于培養板孔中，或滴加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋。
E、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘
F、隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-EGFP為綠色熒光，PI為紅色熒光。
