一、 原理
本試劑盒採用間接競爭ELISA方法檢測水產和雞肉等組織樣本中的硝呋索爾，在微孔條上預包被上偶聯抗原，利用抗原與抗體的特異性免疫化學反應的原理來進行的，樣本中的硝呋索爾和微孔條上預包被偶聯抗原競爭抗硝呋索爾衍生物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣品中的硝呋索爾含量與樣品的吸光度值呈反比，與標準曲線比較即可得出硝呋索爾含量。
二、 試劑盒技術指標：
試劑盒靈敏度： 0.1ppb
樣本檢測下限：
組織、蜂蜜 0.2ppb
魚/蝦等水產品組織因存在一定的干擾，檢測下限為0.3ppb
回收率：
魚/蝦水產組織 90%±15%
蜂蜜/雞肉/肝臟樣本 80%±15%
交叉反應率：
硝呋索爾代謝物 100%
呋喃唑酮代謝物 ﹤0.1%
呋喃妥因代謝物﹤0.1%
呋喃西林代謝物﹤0.1%
三、試劑盒組成
1．微量測試孔：96T/8孔
2．標準品液： 0ppb 0.1 ppb 0.3ppb 0.9ppb 2.7ppb 8.1ppb （1ml/瓶）
3．酶標記物 12ml
4．抗體工作液 7ml
5．底物緩衝液 7 ml
6．底物液 7 ml
7．終止液 7 ml
8．20倍濃縮洗滌液 50 ml
9．復溶液 50 ml
10．15.1mg衍生化試劑
四、 所用儀器、試劑
具備的儀器： 微孔酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振盪器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器： 單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道250µl
試 劑： 甲醇、氫氧化鈉、乙酸乙酯、正己烷、濃HCl、磷酸氫二鉀、鄰硝基苯甲醛、亞硝基鐵氰化鉀（K2Fe（CN）5·NO·3H2O）ZnSO4·7H2O
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否乾淨，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。
樣本前處理需配製：
1．衍生化試劑 稱15.1mg鄰硝基苯甲醛加甲醇10ml溶解(濃度10mM)
2．C液：（供奶樣用）稱12.5g亞硝基鐵氰化鉀用去離子水定溶至100ml。
D液：（供奶樣用）稱29.8g 硫酸鋅用去離子水溶解定溶至100ml。
3．0.1M K2HPO4 稱22.8g K2HPO4·3H2O
加去離子水溶解定溶至1L
4．1M HCl取8.6ml濃HCl加水定溶至100ml。
5．1M NaOH稱取4g NaOH加水定溶至100ml。
樣本的處理
(a) 肉樣或魚蝦
用均質器均質樣本,接（d）的描述方法
(b) 奶樣
1. 取出5ml的奶樣本到玻璃離心管中,分別加入C液和D液各250µl。
2. 用振盪器充分混合樣本,用恆溫離心機4000r/min以上離心10min(4-12℃).若沒有恆溫離心機,則先將樣本降溫至大約8℃,然後離心。
3. 接(d)的描述方法
(c) 蜂蜜
1. 取1±0.05g樣本到離心管中。
2. 加入4ml的去離子水溶解,再加入0.5ml 1M HCl和100µl衍生化試劑,充分振盪。
3. 接(d)第2步描述方法
(d)接上面的方法
1. 取1±0.05g的均質樣本(肉樣/魚蝦)、牛奶的離心上清液1.1ml（相當1ml奶樣），分別加入4ml的去離子水，0.5ml 1M HCl和100µl衍生化試劑，充分振盪。
2. 置於56℃環境中孵育（2h）。
3. 分別加入5ml 0.1M K2HPO4， 0.4 ml 1M NaOH和5ml的乙酸乙酯，充分振盪30s；
4. 在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min。
5. 取出2.5ml的乙酸乙酯到另一潔淨容器中于50℃氮氣/空氣吹干。
6. 用1ml正己烷溶解乾燥物，用1ml已稀釋好的復溶液充分混合；在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min。
7. 取50µl下層相用於分析。
樣本稀釋倍數：2
六、操作步驟
1． 將試劑盒從冷藏環境中取出並將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2． 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存於2-8℃，不要冷凍。
3． 加標準品/樣本50µl /孔，然後加入抗體工作液50µl /孔，再振盪混勻，用封板膜蓋板，室溫反應30min。
4． 洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。
5． 加入酶標記物100µl /孔，用封板膜蓋板，室溫反應20min。
6． 洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。
7．顯色：每孔加入底物緩衝液50µl，再加底物液50µl，輕輕振盪混勻，25℃環境避光顯色10min。
8．測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振盪勻，設定酶標儀于450nm處（在20min內讀完數據），測定吸光度值。
七、結果判定
以標準品百分吸光率為縱坐標，以硝呋索爾標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中硝呋索爾實際濃度。
八、注意事項
1．室溫低於20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2．洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3．混合要均勻，洗板要徹底，否則會出現重複性不好的現象。
4．反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5．將不用的微孔板放進自封袋重新密封; 標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
6．不要使用過了有效日期的試劑盒，不要使用不同批號試劑盒中的試劑。
7．顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之，0標準的吸光度值小於0.6時，表示試劑可能變質。
8．該試劑盒最佳反應溫度為25 ℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
九、儲藏條件和保質期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒
