碧波DNA Ladder檢測試劑盒
一、產品簡介
DNA ladder也稱DNA fragmentation，是細胞凋亡的一個重要指標。通常觀察到DNA ladder，就可以判定細胞發生了凋亡。在細胞發生凋亡時，核酸內切酶被激活，選擇性降解染色質DNA，形成50-300 kb的大片段，並進而在核小體連接處斷裂，形成180-200 bp或其整倍數的DNA片段，這些DNA片段可從細胞中提取出來，通過瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色呈現為梯狀條帶（DNA Ladder），並據此判斷細胞凋亡產生。DNA Ladder檢測試劑盒提供了一種簡便、快速地提取染色質DNA的方法，並增加對小片段DNA的回收，從而增強了檢測的敏感性。
本試劑盒可應用於培養細胞凋亡檢測（不推薦用於檢測組織樣本）。
二、試劑盒組份
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組份
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Cat:BA1520
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Cat: BA1550
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Cat: BA15100
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儲存條件
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裂解液
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4 mL
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10 mL
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20 mL
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4℃
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溶液A
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400μL
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1.0 mL
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2.0 mL
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4℃
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酶1
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400μL
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1.0 mL
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2.0 mL
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-20℃
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酶2
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400μL
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1.0 mL
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2.0 mL
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-20℃
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沉澱液
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3.0 mL
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6.5 mL
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13.0 mL
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4℃
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上樣液
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80μL
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0.2 mL
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0.4 mL
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4℃
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三、試劑盒以外自備儀器和試劑
高速離心機、移液器、渦旋振盪器、電泳儀、水浴鍋，1.5m L 離心管、PBS、胰酶消化液、冰乙醇、TE Buffer，瓊脂糖，TBE、溴化乙啶、DNA Ladder Marker
四、保存條件：
酶-20℃保存。其他溶液可4℃保存
五、注意事項：
1、DNA Ladder出現在細胞凋亡晚期，觀察細胞形態已發生皺縮出芽，染色質完全凝聚，細胞核已固縮斷裂的凋亡晚期形態，建議該種形態的凋亡細胞比例在30%以上時進行DNA Ladder檢測或先進行Tunel檢測，
2、 DNA Ladder出現在一個較短的時間段，在凋亡早期取樣，則無DNA降解的條帶，而在凋亡末期取樣則產生與細胞坏死相似的DNA彌散條芾。因此取樣時間需根椐不同種類的細胞和誘導劑而摸索確定。
3、貼壁細胞最好不用胰酶消化而用細胞刮收集。
4、某些細胞不產生這種核小體間的DNA斷裂，而是產生50-300kb的大片段斷裂。
5、為了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。
六、操作規程
1、 按常規操作離心收集準備好的105~106細胞（1500×g，離心5min）于1.5mL離心管中；
2、 用PBS洗滌細胞二次（1500×g，離心5min），棄上清；
3、 沉澱的細胞中加入100μL裂解液，渦旋振盪器上劇烈混合10秒，離心（1000×g， 5min）后轉移上清于另一1.5mL離心管中；
4、 沉澱再加入100μL 裂解液重複第3步，合併兩次的上清液；
5、 在上述合併的上清液中加入20μL 溶液A，再加入20μL 酶 A，輕輕混勻后于55℃反應1小時；
6、 加入20μL 酶 B,輕輕混勻后于37℃孵育1小時；
7、 加入130μL 沉澱液和950μL冰乙醇, 混勻，置-20℃,1小時以上或過夜；
8、 4℃，離心（12，000-14，000 rpm， 15-30min），小心地移棄上清，收集沉澱的DNA；
9、 加入0.5mL 70%的冰乙醇，洗滌DNA沉澱，再離心（12，000-14，000 rpm， 20min）；
10、棄上清，DNA沉澱于室溫乾燥10 min后，加入10-15μL TE Buffer，充分溶解DNA；
11、取上述10-15μL樣品加入2-3μL 上樣液， 1.5%瓊脂糖凝膠電泳（凝膠和電泳緩衝液TBE均加入0.5μg/mL的溴化乙啶）；
12、5V/cm電泳1小時，紫外燈下觀察並拍照。
