碧波一步法TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（通用型，適用於細胞、組織樣本）
一、產品簡介
一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)為您提供了一種高靈敏度又快速簡
便的細胞凋亡檢測方法。對於經過固定和洗滌的細胞或組織，只要經過一步染色反應，洗滌后就可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測到凋亡細胞。
細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以發現180-200bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上熒光素(FITC)標記的dUTP(fluorescein-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測；由於正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被標記。這就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細胞凋亡的原理。
本試劑盒適用於組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞塗片）的凋亡原位檢測。
本試劑盒有如下優點：
1、高靈敏度：可以在單細胞水平檢測到細胞凋亡，同時由於凋亡早期就有DNA斷裂，可以檢測到早期的細胞凋亡。
2、特異性：TUNEL檢測時通常更容易標記凋亡細胞，而不容易標記坏死細胞。
3、快速：僅需約1-2個小時即可完成。
4、操作簡單：只需一步染色反應，洗滌后即可觀察，不必使用二抗等進行多步操作。
5、應用範圍廣：可以用於檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可以檢測培養的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。
二、試劑盒組份
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組 份
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Cat: BA2420
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Cat: BA2450
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Cat: BA24100
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儲存條件
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平衡液
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1.0 mL
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2.5 mL
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5.0 mL
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-20℃
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熒光標記液
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20μL
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50μL
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100μL
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-20℃避光
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TdT酶
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80μL
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200μL
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400μL
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-20℃
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50×蛋白酶 K
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40μL
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100μL
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200μL
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-20℃
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三、試劑盒以外自備儀器和試劑
二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、檸檬酸鈉、蓋玻片、載玻片、染色缸、熒光顯微鏡
四、保存條件：
-20℃保存，熒光標記液需避光保存。
五、注意事項：
1、TUNEL法特異性檢測細胞凋亡時產生的DNA斷裂，但不會檢測出射線等誘導的DNA斷裂(和細胞凋亡時的斷裂方式不同)。這樣一方面可以把凋亡和坏死區分開，另一方面也不會把射線等誘導發生DNA斷裂的非凋亡細胞判斷為凋亡細胞。
2、極少數細胞凋亡時沒有DNA斷裂，此時不適用TUNEL法檢測。在個別類型的坏死細胞中也發現TUNEL檢測呈陽性。在需要嚴格判斷細胞凋亡的情況下，最好同時檢測多個凋亡指標。
3、使用前請認真閱讀本說明書，提前準備好相關試劑。
4、因本試劑盒中組分均為微量，使用前請離心。
5、為避免試驗誤差、降低試劑的損耗，建議使用精密度高的進口微量移液槍及槍頭。
6、 TdT 酶反應液最好在使用前根椐樣本數量集中配製，再分別滴加于各樣本片上，避免每個樣本單獨配製而產生的試劑損耗。
7、為了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。
六、操作規程
A、檢測樣本的預處理
TUNEL檢測時樣本的預處理是試驗的關鍵所在，本說明書推薦的條件僅為普遍情況，用戶需根椐自已的樣
本材料及首次試驗結果來調整各個條件，如處理時間、處理濃度等，來優化出適合自身樣本的試驗條件，從而做出客觀的試驗結果。
1、 對於細胞樣本
a、 把準備好的細胞塗片或爬片自然晾乾。
b、 把晾乾的樣本浸入固定液，室溫（15-25℃）固定15-60min。
（固定液的配製：4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鮮配製）
c、 把固定好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
d、 把c步處理好的樣本浸入封閉液中，室溫（15-25℃）封閉10min。
（封閉液的配製：3%H2O2溶于無水甲醇）
e、 把d步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
f、 把e步處理好的樣本浸入通透液中，冰上（2-8℃）促滲2min。
（通透液的配製：0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配製）
g、 然後轉入B步驟標記反應。
注意事項：
a、 為防止樣本脫落，請使用硅烷（Silane）處理的載玻片或採用多聚賴氨酸鋪片。
b、 固定好的樣本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分鐘～一晚，以改善細胞的滲透性。
c、 使用PBS漂洗細胞樣本時，不要直接加在細胞樣本上，以防止細胞樣本的脫落。
d、 固定液、PBS、封閉液、通透液、染色缸需用戶自備，請按上述方法配製。
2、 對於石蠟切片
a、 按常規方法將石蠟切片進行脫蠟及水合
（如：二甲苯脫蠟2次，每次5-10 min；乙醇水合（將脫蠟好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））
b、 把a步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
c、 把b步處理好的樣本加入蛋白酶K工作液， 21-37℃作用15-30min。
（蛋白酶K工作液的配製：2μL 50×蛋白酶K＋98μL PBS）
d、 把c步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
e、 把d步處理好的樣本浸入封閉液中，室溫（15-25℃）封閉10min。
（封閉液的配製：3%H2O2溶于甲醇）
f、 把e步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
g、 然後轉入B步驟標記反應。
注意事項：
a、 蛋白酶K處理的使用濃度、處理時間及溫度，都因組織的類型不同而有所不同，需要自已摸索優化上述條件，如有問題，請根椐本說明書的《常見問題的原因及推薦解決方案》來調整條件。例如：如果凋亡細胞染色較弱時，可用高濃度的Proteinase K（400μg/mL）處理5分鐘。（本試劑盒的50×Proteinase K濃度為1mg/mL）。
b、 其它替代方法：石蠟切片的預處理也可根椐實際情況可採用下述三種替代方法之一，即蛋白酶K處理的步聚改用下述方法，其餘步聚均相同：
替代方法1:
將脫蠟及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液的配製：0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配製）
替代方法2：
將脫蠟及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶溶液的配製：0.25%-0.5%溶于HCl PH2；胰蛋白酶溶液的配製：0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）
替代方法3:
將脫蠟及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的檸檬酸緩衝液PH= 6 的塑料盒中，置於微波爐中350W（低檔）處理5 min。為防止樣本脫落，請使用硅烷（Silane）處理的載玻片或採用多聚賴氨酸鋪片。
c、 使用酶處理切片時一定要把酶洗滌乾淨，否則會嚴重干擾後續的標記反應。
3、 對於冷凍切片
a、 把冰凍切片浸入固定液，室溫（15-25℃）固定30min。
（固定液的配製：4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鮮配製）
b、 把a步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次，每次15min。
c、 把b步處理好的樣本浸入封閉液中，室溫（15-25℃）封閉10min。
（封閉液的配製：3%H2O2溶于甲醇）
d、 把c步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
e、 把d步處理好的樣本浸入通透液中，冰上（2-8℃）促滲2min
（通透液的配製：0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配製）
f、 然後轉入B步驟標記反應。
4、對於難處理的切片
a、 按常規方法將石蠟切片進行脫蠟及水合
（如：二甲苯脫蠟2次，每次5-10 min；乙醇水合（將脫蠟好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））
b、 把a步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
c、 把b步處理好的樣本加入浸入含200ml 0.1M的檸檬酸緩衝液PH= 6 的塑料盒中，置於微波爐中750W（高檔）處理1 min
d、 迅速加入80ml雙蒸水（20-25℃）加入c步處理好切片的塑料盒中，冷卻至室溫，將組織切片轉移至PBS（20-25℃）中。
e、 把d步處理好的樣本浸入封閉液中，室溫（15-25℃）封閉10min。
（封閉液的配製：0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清）
f、 把e步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次，每次10min。
g、 然後轉入B步驟標記反應。
5、陽性對照及陰性對照的準備
TUNEL檢測同時需要設陽性和陰性對照，以顯示試驗的客觀性及準確性。因此需要按下述方法準備兩個樣本來制備陽性及陰性片，其後續步聚與待測樣本同樣進行。
a、陽性對照樣本的準備
組織樣本在蛋白酶K處理、PBS浸洗后，細胞樣本在Triton X-100通透液處理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反應液（用戶自備）室溫—37℃處理10 -30 min，其餘步驟均相同。
（DNase I反應液的配製：10u-3000u DNase I,40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2）
b、陰性對照樣本的準備
在標記反應的過程中不添加TdT酶反應液，其餘步驟均相同。
B、 標記反應：
1、 預處理好的樣本PBS漂洗2次，每次5min后，樣本週圍用濾紙或吸水紙吸干。
2、 配製TdT酶反應液：
參考下表配製適當量的TdT酶反應液（根據需要按照比例放大），需充分混勻。注意：配製好的TdT酶反應液必須一次使用完畢，不能凍存。
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1個樣品
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5個樣品
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10個樣品
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平衡液
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45µl
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225µl
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450µl
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熒光標記液
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1µl
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5µl
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10µl
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TdT酶
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4µl
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20µl
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40µl
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TdT酶反應液總體積
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50µl
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250µl
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500µl
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3、 每個樣本滴加50μL TdT酶反應液，加蓋玻片37℃避光濕潤反應60min。（陰性對照片不加TdT酶）
4、 把第3步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
5、 熒光顯微鏡下觀察，可以使用的激發波長範圍為450-500nm，發射波長範圍為515-565nm(綠色熒光)。
操作注意事項：
1、 PBS清洗后，為了各種反應的有效進行，請儘量除去PBS溶液后再進行下一步反應。
2、 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液后，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進行，這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應液乾燥造成實驗失敗。
3、 TdT酶反應液即用即配，短暫于冰上保存。不宜長期保存，長期保存會導酶活性的失活。
