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使用前仔細閱讀本說明書。本酶聯免疫試劑盒是基於生物素雙抗體夾心技術原理，來檢測小鼠Toll樣受體4(TLR4))，只能用于研究用途，不得用於醫學診斷。

 

用    途： 用於小鼠血清、血漿及相關液體樣本中Toll樣受體4(TLR4)的測定。

工作原理

本試劑盒採用的是生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）測定樣品中小鼠Toll樣受體4(TLR4)的水平。向預先包被了小鼠Toll樣受體4(TLR4)單克隆抗體的酶標孔中加入Toll樣受體4(TLR4)，溫育；溫育后，加入生物素標記的抗TLR4抗體，再與鏈霉親和素-HRP結合，形成免疫復合物，再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶，然後加入底物A、B，產生藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中小鼠Toll樣受體4(TLR4)的濃度呈正相關。

試劑盒組成

1	標準品（16ng/ml）	0.5ml	7	顯色劑A液	6ml
2	標準品稀釋液	3ml	8	顯色劑B液	6ml
3	酶標包被板	12孔×8條	9	終止液	6ml
4	鏈霉親和素-HRP	6ml	10	說明書	1份
5	30倍濃縮洗滌液	20ml	11	封板膜	2張
6	生物素標記的抗- TLR4抗體	1ml	12	密封袋	1個

需要而未提供的試劑和器材

1．   37℃恆溫箱。

2．   標準規格酶標儀。

3．   精密移液器及一次性吸頭

4．   蒸餾水，

5．   一次性試管

6．   吸水紙

注意事項

1．   從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2．   各步加樣均應使用加樣器，並經常校對其準確性，以避免試驗誤差。

3．   嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準。

4．   為避免交叉污染，要避免重複使用手中的吸頭和封板膜。

5．   不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

6．   底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊几層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重複此過程數次。

自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

 

標本要求

1．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

2．標本採集后儘早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應儘快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

操作程序

1．   標準品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶請按照說明自行在小試管中倍比稀釋）：

8ng/ml	（5號標準品）	120μl的原倍標準品加入120μl的標準品稀釋液
4ng/ml	（4號標準品）	120μl的5號標準品加入120μl的標準品稀釋液
2ng/ml	（3號標準品）	120μl的4號標準品加入120μl的標準品稀釋液
1ng/ml	（2號標準品）	120μl的3號標準品加入120μl的標準品稀釋液
0.5ng/ml	（1號標準品）	120μl的2號標準品加入120μl的標準品稀釋液

2．   根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的儘量做復孔。

3．   加樣：1）空白孔：空白對照孔不加樣品，生物素標記的抗TLR4抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其餘各步操作相同；2）標準品孔：加入標準品50μl，鏈黴素-HRP50μl（標準品中已事先整合好生物素抗體，故不加）；3)待測樣品孔:加入樣本40μl，然後各加入抗- TLR4抗體10μl、鏈酶親和素-HRP50μl，蓋上封板膜，輕輕振盪混勻，37℃溫育60分鐘。

4．   配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋後備用。

5．   洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重複5次，拍干。

6．   顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震盪混勻，37℃避光顯色10分鐘。

7．   終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

8．   測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后10分鐘以內進行。

9.根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來計算。