碧波線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)
一、產品簡介
線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標誌性事件,它發生在細胞核凋亡特征（染色質濃縮、DNA斷裂）出現之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。
JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)是一種廣氾用於檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential) ∆Ψm 的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態，在低濃度時以單體的形式存在，高濃度時以多聚體形式存在，兩者的發射光譜不同。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體(monomer)，可以產生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。
線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1) (Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用於早期的細胞凋亡檢測。
¾?JC-1單體的最大激發波長為514nm，最大發射波長為529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激發波長為585nm，最大發射波長為590nm。實際觀察時，使用常規的觀察紅色熒光和綠色熒光的設置即可。
二、試劑盒組份
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組份
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Cat:BA1410
10 assays
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Cat:BA1420
20 assays
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Cat:BA1450
50 assays
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Cat:BA14100
100 assays
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儲存條件
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JC-1
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10μL
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20μL
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50μL
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100μL
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-20℃避光
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10×染色結合液
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2.0 mL
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4.0 mL
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10 mL
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20 mL
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4℃
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三、試劑盒以外自備儀器和試劑
流式細胞儀或熒光顯微鏡、高速離心機、移液器、1.5m L離心管、載玻片、蓋玻片、PBS、滅菌雙蒸水
四、保存條件：
-20℃保存。JC-1需避光保存，並儘量避免反復凍融。J染色結合液也可4℃保存
五、注意事項：
1、JC-1在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
2、對PH變化過於敏感的細胞建議用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗滌，或延長觀測時間。
3、流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化受到多種因素的影響，因誘導劑、細胞株類型，作用時間的不同而熒光強度比例都有不同，因此沒有通用標準的補償設門指南，因此每個試驗需設陰性及陽性對照組進行熒光補償及設門。
4、加入JC-1並洗滌后儘量在30分鐘內完成後續檢測。
5、組織需先制備單細胞懸液或提取純化線粒體后方可進行檢測。
6、如果發現染色結合緩衝液中有沉澱，必須全部溶解后才能使用。
7、為了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。
六、操作規程
1、JC-1染色工作液的配製：
a、取100μL 10×染色結合液加900μL滅菌雙蒸水稀釋成1×染色結合液，混勻並預熱至37℃；
b、吸取500μL 1×染色結合液，加入1μL JC-1，劇烈Vortex充分溶解，混勻配成JC-1工作液；
c、因JC-1在水中的溶解度很小，所以可以通過離心的方法（10，000rpm，1min）去除不溶的顆粒，吸取離心后的上清使用，以消除干擾。離心后的上清為JC-1工作液
2、用適當的方法誘導細胞凋亡，同時設立陰性對照組和陽性對照組【用適當的凋亡誘導劑，誘導適當時間后經其它檢測（如AnnexinV或 Caspase 3活性）証實確有凋亡產生】，收集細胞；
3、用PBS洗滌細胞二次（離心2000rpm，5min），收集不多於1×106的細胞；
4、取500μL JC-1工作液將細胞均勻懸浮，37℃，5%CO2的培養箱中孵育15~20min；
5、室溫離心（2000rpm，5min）收集細胞，用500μL 1×染色結合液洗滌兩次；
6、吸取500μL 1× Incubation Buffer重新懸浮細胞；
7、 熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀分析。
A、熒光顯微鏡觀察
1． 滴一滴上述細胞懸液于載玻片，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察；
2． 對於貼壁細胞來說，也可直接用蓋玻片來培養細胞並誘導細胞凋亡；用PBS洗滌細胞兩次；
滴加100μL JC-1工作液，加蓋玻片，37℃，5%CO2的培養箱中孵育15~20min；1×染色結合液洗滌1~2遍；將蓋玻片倒置於載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察；
檢測JC-1單體時可以把激發光設置為490nm，發射光設置為530nm；檢測JC-1聚合物時，可以
把激發光設置為525nm，發射光設置為590nm。注意：此處測定熒光時不必把激發光和發射光設置在
最大激發波長和最大發射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測JC-1單體時可以參考觀察其它綠色熒光
時的設置，如觀察GFP或FITC時的設置；檢測JC-1聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙
啶或Cy3時的設置。出現綠色熒光說明線粒體膜電位下降，並且該細胞很可能處於細胞凋亡早期。出
現紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態也比較正常。
B、流式細胞儀分析
用流式細胞儀檢測（Ex=488 nm; Em=530 nm）細胞凋亡的情況，綠色熒光通過FITC通道通常為FL1來檢測；紅色熒光通過PI通道通常為FL2來檢測。.正常細胞{FL-1亮,FL-2亮; R1}，凋亡細胞 {FL-1亮, FL-2暗; R2}，設門的位置根椐細胞種類、實驗條件等不同而變化，試驗需設未經處理的正常細胞為陰性對照組和陽性對照組，根椐陰性和陽性對照組的雙參數散點圖來設定門的位置。
