碧波TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(顯色法)（通用型，適用於細胞、組織樣本）
一、產品簡介
TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)為您提供了一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡檢測方法。對於待檢測的細胞或組織樣品，經過生物素標記和後續的DAB顯色等步驟，即可在普通光學顯微鏡檢測到凋亡的細胞。
細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以發現180-200bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)標記的dUTP(Biotin-dUTP)，隨後和辣根過氧化物酶(HRP)標記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)結合，最後在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞，從而可以通過普通光學顯微鏡檢測到凋亡的細胞；由於正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被標記。這就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細胞凋亡的原理。
本試劑盒適用於組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞塗片）的凋亡原位檢測。
本試劑盒有如下優點：
1、 高靈敏度：可以在單細胞水平檢測到細胞凋亡，同時由於凋亡早期就有DNA斷裂，可以檢測到早期的細胞凋亡。
2、 操作簡便：使用Ready-to-Use型試劑，並配有Proteinase K 和DAB。
3、 特異性：TUNEL檢測時通常更容易標記凋亡細胞，而不容易標記坏死細胞。
4、 快速：僅需約3個小時即可完成。
5、 應用範圍廣：可以用於檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可以檢測培養的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。
6、 方便觀察：使用光學顯微鏡觀察實驗結果，無需貴重設備。
二、試劑盒組份
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組 份
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Cat: BA2020
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Cat: BA2050
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Cat: BA20100
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儲存條件
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平衡液
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1.0 mL
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2.5 mL
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5.0 mL
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-20℃
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TdT酶
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80μL
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200μL
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400μL
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-20℃
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50×蛋白酶 K
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40μL
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100μL
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200μL
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-20℃
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Streptavidin-HRP
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10μL
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25μL
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50μL
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4℃避光
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Biotin-dUTP
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20μL
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50μL
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100μL
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-20℃
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DAB
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2mg
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5mg
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10 mg
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-20℃避光
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三、試劑盒以外自備儀器和試劑
二甲苯、多聚甲醛、甲醇、乙醇、PBS、H2O2 、TritonX-100、檸檬酸鈉、復染染液：甦木素或甲基綠等；
蓋玻片、載玻片、染色缸、染色濕盒、光學顯微鏡、37℃孵箱、移液器等。
四、保存條件：
-20℃保存，Streptavidin-HRP和DAB需避光保存。
五、注意事項：
1、TUNEL法特異性檢測細胞凋亡時產生的DNA斷裂，但不會檢測出射線等誘導的DNA斷裂(和細胞凋亡時的斷裂方式不同)。這樣一方面可以把凋亡和坏死區分開，另一方面也不會把射線等誘導發生DNA斷裂的非凋亡細胞判斷為凋亡細胞。
2、極少數細胞凋亡時沒有DNA斷裂，此時不適用TUNEL法檢測。在個別類型的坏死細胞中也發現TUNEL檢測呈陽性。在需要嚴格判斷細胞凋亡的情況下，最好同時檢測多個凋亡指標。
3、使用前請認真閱讀本說明書，提前準備好相關試劑。
4、因本試劑盒中組分均為微量，使用前請離心。
5、為避免試驗誤差、降低試劑的損耗，建議使用精密度高的進口微量移液槍及槍頭。
6、 TdT 酶反應液最好在使用前根椐樣本數量集中配製，再分別滴加于各樣本片上，避免每個樣本單獨配製而產生的試劑損耗。
7、為防止樣本脫落，請使用硅烷（Silane）處理的載玻片或採用多聚賴氨酸鋪片。
8、DAB為固體粉末，使用前加入PBS配製成20×DAB（10 mg/ml）后，按說明書顯色使用。
9、為了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。
六、操作規程
A、檢測樣本的預處理
TUNEL檢測時樣本的預處理是試驗的關鍵所在，本說明書推薦的條件僅為普遍情況，用戶需根椐自已的樣
本材料及首次試驗結果來調整各個條件，如處理時間、處理濃度等，來優化出適合自身樣本的試驗條件，從而做出客觀的試驗結果。
1、 對於細胞樣本
a、 把準備好的細胞塗片或爬片自然晾乾。
b、 把晾乾的樣本浸入固定液，室溫（15-25℃）固定15-60min。
（固定液的配製：4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鮮配製）
c、 把固定好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
d、 把c步處理好的樣本浸入封閉液中，室溫（15-25℃）封閉10min。
（封閉液的配製：3%H2O2溶于無水甲醇）
e、 把d步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
f、 把e步處理好的樣本浸入通透液中，冰上（2-8℃）促滲2min。
（通透液的配製：0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配製）
g、 然後轉入B步驟標記和顯色反應。
注意事項：
a、 為防止樣本脫落，請使用硅烷（Silane）處理的載玻片或採用多聚賴氨酸鋪片。
b、 固定好的樣本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分鐘或過夜，以改善細胞的滲透性。
c、 使用PBS漂洗細胞樣本時，不要直接加在細胞樣本上，以防止細胞樣本的脫落。
d、 固定液、PBS、封閉液、通透液、染色缸需用戶自備，請按上述方法配製。
2、 對於石蠟切片
a、 按常規方法將石蠟切片進行脫蠟及水合
（如：二甲苯脫蠟2次，每次5-10 min；乙醇水合（將脫蠟好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））
b、 把a步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
c、 把b步處理好的樣本加入蛋白酶K工作液， 21-37℃作用15-30min。
（蛋白酶K工作液的配製：2μL 50×蛋白酶K＋98μL PBS）
d、 把c步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
e、 把d步處理好的樣本浸入封閉液中，室溫（15-25℃）封閉10min。
（封閉液的配製：3%H2O2溶于甲醇）
f、 把e步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
g、 然後轉入B步驟標記和顯色反應。
注意事項：
a、 蛋白酶K處理的使用濃度、處理時間及溫度，都因組織的類型不同而有所不同，需要自已摸索優化上述條件，如有問題，請根椐本說明書的《常見問題的原因及推薦解決方案》來調整條件。例如：如果凋亡細胞染色較弱時，可用高濃度的Proteinase K（400μg/mL）處理5分鐘。（本試劑盒的50×Proteinase K濃度為1mg/mL）。
b、 其它替代方法：石蠟切片的預處理也可根椐實際情況可採用下述三種替代方法之一，即蛋白酶K處理的步聚改用下述方法，其餘步聚均相同：
替代方法1:
將脫蠟及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液的配製：0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配製）
替代方法2：
將脫蠟及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶溶液的配製：0.25%-0.5%溶于HCl PH2；胰蛋白酶溶液的配製：0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）
替代方法3:
將脫蠟及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的檸檬酸緩衝液PH= 6 的塑料盒中，置於微波爐中350W（低檔）處理5 min。為防止樣本脫落，請使用硅烷（Silane）處理的載玻片或採用多聚賴氨酸鋪片。
c、 使用酶處理切片時一定要把酶洗滌乾淨，否則會嚴重干擾後續的標記反應。
3、 對於冷凍切片
a、 把冰凍切片浸入固定液，室溫（15-25℃）固定30min。
（固定液的配製：4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鮮配製）
b、 把a步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次，每次15min。
c、 把b步處理好的樣本浸入封閉液中，室溫（15-25℃）封閉10min。
（封閉液的配製：3%H2O2溶于甲醇）
d、 把c步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
e、 把d步處理好的樣本浸入通透液中，冰上（2-8℃）促滲2min
（通透液的配製：0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配製）
f、 然後轉入B步驟標記和顯色反應。
4、對於難處理的切片
a、 按常規方法將石蠟切片進行脫蠟及水合
（如：二甲苯脫蠟2次，每次5-10 min；乙醇水合（將脫蠟好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））
b、 把a步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
c、 把b步處理好的樣本加入浸入含200ml 0.1M的檸檬酸緩衝液PH= 6 的塑料盒中，置於微波爐中750W（高檔）處理1 min。
d、 迅速加入80ml雙蒸水（20-25℃）加入c步處理好切片的塑料盒中，冷卻至室溫，將組織切片轉移至PBS（20-25℃）中。
e、 把d步處理好的樣本浸入封閉液中，室溫（15-25℃）封閉10min。
（封閉液的配製：0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清）
f、 把e步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次，每次10min。
g、 然後轉入B步驟標記和顯色反應。
5、陽性對照及陰性對照的準備
TUNEL檢測同時需要設陽性和陰性對照，以顯示試驗的客觀性及準確性。因此需要按下述方法準備兩個樣本來制備陽性及陰性片，其後續步聚與待測樣本同樣進行。
a、陽性對照樣本的準備
樣本在蛋白酶K處理、PBS浸洗后，細胞樣本在Triton X-100通透液處理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反應液（用戶自備）室溫—37℃處理10 -30 min，其餘步驟均相同。
（DNase I反應液的配製：10u-3000u DNase I,40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2）
b、陰性對照樣本的準備
在標記反應的過程中不添加TdT酶反應液，其餘步驟均相同。
B、 標記和顯色反應：
1、 預處理好的樣本PBS漂洗2次，每次5min后，樣本週圍用濾紙或吸水紙吸干。
2、 配製TdT酶反應液：
參考下表配製適當量的TdT酶反應液（根據需要按照比例放大），需充分混勻。注意：配製好的TdT酶反應液必須一次使用完畢，不能凍存。
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1個樣品
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5個樣品
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10個樣品
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平衡液
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45µl
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225µl
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450µl
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Biotin-dUTP
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1µl
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5µl
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10µl
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TdT酶
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4µl
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20µl
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40µl
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TdT酶反應液總體積
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50µl
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250µl
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500µl
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3、 每個樣本滴加50μL TdT酶反應液，加蓋玻片37℃避光濕潤反應60min。（陰性對照片不加TdT酶）
4、 把第3步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
5、 Streptavidin-HRP及DAB工作液的配製：
Streptavidin-HRP工作液的配製：
參考下表配製適量的Streptavidin-HRP工作液，需充分混勻。注意：配製好的Streptavidin-HRP工作液必須一次使用完畢，不宜凍存。
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1個樣品
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5個樣品
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10個樣品
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Streptavidin-HRP
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0.5µl
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2.5µl
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5µl
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PBS
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99.5µl
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497.5µl
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995µl
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Streptavidin-HRP工作液總體積
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100µl
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500µl
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1000µl
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DAB工作液的配製：
a、先把試劑盒中DAB粉末用PBS溶解配製成20×DAB（10 mg/ml），配製方法如下：
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DAB
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2mg
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5mg
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10mg
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PBS
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0.2ml
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0.5ml
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1.0ml
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配製成20×DAB（10 mg/ml），放于-20℃保存
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b、DAB工作液的配製：
參考下表配製適量的DAB工作液，需充分混勻。注意：配製好的DAB工作液必須一次使用完畢，不宜凍存。
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1個樣品
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5個樣品
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10個樣品
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20×DAB（10 mg/ml）
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5µl
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25µl
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50µl
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30％H2O2
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1µl
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5µl
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10µl
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PBS
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94µl
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470µl
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940
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DAB工作液總體積
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100µl
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500µl
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1000µl
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6、 將第5步處理好的樣本週圍用濾紙或吸水紙吸干，再滴加50μL Streptavidin-HRP工作液，加蓋玻片37℃濕潤避光反應30min。
7、 把第6步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min，樣本週圍用濾紙或吸水紙吸干。
8、 將第7步處理好的樣本滴加50μL-100μL DAB工作液，室溫孵育5-30分鐘或根據顯色情況孵育適當時間。注意：如果顯色很強可以短于5分鐘即停止顯色，如果顯色很弱，可以適當延長顯色時間，甚至顯色過夜。
9、 把第8步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min，可直接光學顯微鏡下觀察、拍照。
10、選做(本步驟可不做)：用甦木素染色液或甲基綠染色液進行細胞核染色。隨後用PBS漂洗3次，每次5min，光學顯微鏡下觀察、拍照。
操作注意事項：
1、 PBS清洗后，為了各種反應的有效進行，請儘量除去PBS溶液后再進行下一步反應。
2、 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液后，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進行，這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應液乾燥造成實驗失敗。
3、 TdT酶反應液即用即配，短暫于冰上保存。不宜長期保存，長期保存會導酶活性的失活。
4、 如果20×DAB溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配製。
5、 甦木素復染：將切片放入甦木素染液，染色 30min ，蒸餾水沖洗乾淨后放入鹽酸甲醇溶液中5s，立即用蒸餾水沖洗乾淨。分別用70%、85%、95%、無水乙醇浸泡5min。用二甲苯浸泡10min，更換二甲苯后再浸泡10min。晾乾后在切片上加中性樹膠，加蓋玻片。
七、常見問題的原因及推薦解決方案.
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現象
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可能原因
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建議
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非特異性染色
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TdT酶的濃度過高
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用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀釋
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TdT酶反應時間過長或TdT酶反應過程中反應液滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤。
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注意控制反應時間，並確保TdT酶反應液能很好地覆蓋樣品。
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光照紫外線導致包埋試劑的聚合（如：甲基丙烯酸會導致樣本DNA的斷裂）
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嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試劑
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在固定組織時樣本DNA已斷裂（內源核酸酶的作用）
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確保樣品取樣后立即固定或通過肝靜脈灌注固定
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使用了不適當的固定液，例如一些酸性固定液
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採用推薦的固定液
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固定後某些核酸酶活性依然較高導致DNA斷裂
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用含有dUTP和 dAPT的溶液封閉
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標記率低
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如果以乙醇或甲醇固定的樣本則標記效率較低（因為在固定時染色質未能與蛋白質交聯，而在操作中丟失）
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用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定
或福爾馬林或戊二醛固定。
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固定時間過長，導致交聯程度過高
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減少固定時間，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定
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熒光淬滅
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Fluorescence在普通光照10分鐘就會嚴重淬滅，需注意避光操作
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促滲條件不佳，以致于試劑不能到達靶分子或濃度過低
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1、 增加通透劑促滲時間
2、增加通透劑的作用溫度（15-25℃）
3、優化蛋白酶K的作用濃度和作用時間（如：以400ug/ml作用5min）
4、0.1M的檸檬酸鈉70℃作用30min。
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選擇的染料不合適
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用溶于0.1M醋酸巴比妥的3-5%甲基綠PH4.0，或甦木素復染
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染色背景很高
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支原體污染
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請使用支原體染色檢
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