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1．概要

這個軟骨藻酸（ASP）ELISA檢測方法可以很敏感的定量檢測軟骨藻酸的含量。軟骨藻酸是和健忘性貝類毒素相關的一類海藻產生的水溶性毒素。試劑盒用於定量或定性檢測檢測水樣和貝類樣品中軟骨藻酸的含量。貝類樣品需要進行樣品前處理。如果需要可以用傳統的方法例如HPLC,GC/MS來証實。

2．安全說明

試劑盒中的標準溶液里含有少量的軟骨藻酸。底物中包含有四甲基聯苯胺，終止液中含有稀硫酸。要避免

皮膚和粘膜與終止液接觸，如果不小心接觸了請馬上用水沖洗。

3．保存和穩定性

試劑盒應保存在2-8℃，不要冷凍。在使用之前要把試劑盒中的溶液回復到室溫（20-25℃）。有效期內試劑盒中的試劑都可以使用。

4．原理

試劑盒的原理是直接競爭ELISA法，通過特異性抗體來識別軟骨藻酸。當樣品中含有軟骨藻酸時，樣品中的軟骨藻酸與軟骨藻酸酶結合物競爭結合溶液中的軟骨藻酸抗體。軟骨藻酸抗體與包被在微孔板上的羊抗鼠二抗結合。經過一步洗滌加入底物溶液，產生有色反應。產生的綠色的顏色深度與樣品中軟骨藻酸的含量成反比。加入反應停止液后使顏色由藍色轉變為黃色。用酶標儀在450nm處測定吸光度值。通過繪製標準曲線來計算樣品中軟骨藻酸的含量。

A．試劑盒組成：

1、包被二抗的微孔板（羊抗鼠）

2、標準（5種）0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/ml

3、1瓶對照（1ml）濃度3.5 ng/ml

4、軟骨藻酸抗體溶液（鼠抗軟骨藻酸）6ml

5、軟骨藻酸酶標記物6ml

6、樣品稀釋液（25ml）用於稀釋樣品

7、5x濃縮洗液100ml

8、顯色液（底物）TMB,16ml

9、終止液12ml

C.操作步驟

1、在對應的微孔中加入50μL的標準、對照和樣品（推薦做2-3個重複）

2、每個測試孔都加入50 μL軟骨藻酸酶標記物溶液。

3、每個測試孔都加入50 μL軟骨藻酸抗體溶液，用封口膜把微孔板蓋上，輕輕的震盪微孔板30秒使裡面的液體混勻。不要使液體灑出。

4、在室溫下孵育60分鐘。

5、孵育完成后，把封口膜取掉，將微孔中的溶液用力地倒入水槽中，用1X的洗液洗板3次，每孔每次至少加入250 μL1X的洗液。拍板，去掉殘留的洗液。

6、每個測試孔加入100μL的顯色液（底物）。室溫孵育30分鐘，此步驟避免太陽光照射。

7、每個測試孔加入50μL終止液。

8、用酶標儀在450nm 下讀取每個孔的吸光度值（OD）（在加入終止液15分鐘內完成）

D結果分析

結果分析可以利用商業ELISA分析軟件(4-parameters,Logit/Log)。手工計算可以先計算標準的吸光度值的平均值，然後計算每個標準的%B/B0（用其它標準的吸光度值除以零標準的吸光度值乘以100%）。以每個標準的%B/B0做Y軸，以每個標準的軟骨藻酸的濃度做X軸構建標準曲線。通過利用標準曲線，把對照和樣品的%B/B0代入標準可以計算出樣品中軟骨藻酸的濃度。樣品中軟骨藻酸的含量小於0.5 ppb認為陰性。當樣品中軟骨藻酸的含量大於10.0 ppb要稀釋后再測定。