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概述

黃曲霉毒素是由多種黴菌代謝的毒性產物，例如Asperillus flavus和Asperillus parasiticus黴菌。他們具有致癌性，存在於穀物、堅果、棉籽和其它食品或動物飼料中。穀物可能被黃曲霉毒素的衍生物：B1、B2、G1和G2其中一種或幾種污染。AFB1是目前檢測到的最毒的黃曲霉毒素，其他類型的黃曲霉毒素如果污染的濃度很高也存在很大的危險。黃曲霉毒素能夠引發人類很多病症包括肝癌、黃曲霉中毒、萊耶綜合症和慢性肝炎。動物容易攝取到黃曲霉毒素的原因是動物吃的飼料在生長、收割和貯存過程中可能被能夠產生黃曲霉毒素的真菌污染。世界上大多數國家的政府已經對人類和動物性食品中制定了嚴格的黃曲霉毒素限量標準。

適用

REAGEN黃曲霉毒素B1分析測定試劑盒原理是競爭酶聯免疫法，適用於檢測穀物、堅果、棉花種子、加工過的穀類食物、和一些其它的動物食品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1 和G2。

原理

REAGEN黃曲霉毒素B1測定法是一種固相直接競爭酶聯免疫分析測定方法。聚苯乙烯微孔板中包被抗黃曲霉毒素的高親和力抗體，這種抗體和黃曲霉毒素的四種亞型都能發生交叉反應。利用70%甲醇提取樣品中的黃曲霉毒素，把提取的樣品和HRP（辣根過氧化物酶）標記的黃曲霉毒素B1混勻並加入對應的孔檢測。酶標記毒素與標準品或者樣品中黃曲霉毒素競爭與包被在微孔底部的抗體結合。孵育一段時間后，倒出孔里的液體，清洗后加入顯色底物，在酶的作用下孔里將會出現藍色。顯色顏色的深淺與結合物的量成正比例的關係，與標準品或樣品中AFM的量成反比例關係。所以，標準品或樣品中的AFM濃度越高，顯色的藍色將會越淺。加入酸，終止反應，底物顏色由藍色變為棕黃色。微孔板放進酶標儀里，在OD450nm讀取吸光度值。樣品的吸光度值與試劑盒中標準OD值相比較，相對應得出結果。

試劑盒組成
1×小袋
抗體包被的微孔板
96孔板（12×8微孔板用鼠源AF單克隆抗體）

1×
預混板（綠色）
96孔板（12×8）沒有包被抗體

6×小瓶
AFM標準品
1.5mL/瓶，AFM的濃度分別為0.0、0.2、0.5、

1．0、2.0、4.0ng/mL 溶解在有機溶液中。

2×小瓶
HRP-AF偶聯物
2 x 12mL HRP-AFB1添加防腐劑

的緩衝溶液

1×小瓶
底物試劑
15mL TMB，

1×小瓶
終止液
15mL酸性液體


樣品提取步驟

1.制備提取液：70%甲醇，用蒸餾水或無離子水稀釋（每個樣品需要100ml樣品提取液）。

2.研磨樣品（使50%的樣品可以通過一個20目的濾網）。

3.稱量20g研磨過濾后的樣品加入100ml樣品提取液，樣品稀釋比為1:5(w/v)。

4.在混合器上至少震盪2分鐘。

5.用濾紙過濾5-10ml 以上處理的液體，收集濾液待測。

樣品測定步驟

1、使用前將試劑拿到室溫。

2、取出混合板放于微孔支架上用於標準和樣品的測試，取相同數量的微孔（包被有抗體）置於另一個微孔支架上。

3、在每個混合板微孔中加入 200μl酶標結合物。

4、在對應的孔中加入100μl標準或樣品，用槍頭混合3次，

注意：操作者要把每個孔標記清楚

5、轉移100ul預混板微孔中的液體到對應的包被有抗體的微孔中，室溫孵育15分，最好使用多道移液器。

6、將孔里的液體倒入合適的容器中，用蒸餾水或無離子水洗板，然後迅速棄掉洗液到合適的容器中，重複洗5次。在一層厚的吸水紙上拍板，去掉殘留的洗液。

7、在吸水紙上拍打，盡可能地將水拍干。

8、每孔加入100μl底物溶劑，室溫孵育5min。

9、每孔加入100μl終止液。

10、對比標準和樣品的顏色，或在OD450 nm讀數。



結果分析

使用原有的OD值或實驗獲得的OD值與標準曲線中黃曲霉毒素濃度為0時OD值的百分比值與標準中黃曲霉毒素含量建立劑量效應曲線。通過在標準品曲線中添加新數值計算被測物質中黃曲霉毒素的濃度。因為樣品在處理的過程中稀釋了5倍，所以實際值是測定值的5倍。樣品在標準曲線上的稀釋範圍是1-20ppb，如果樣品的濃度大於最高標準，需要用70%的樣品提取液來稀釋后再測定，計算結果時要考慮到稀釋的倍數。