一、原理
本試劑盒採用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的三聚氰胺和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭三聚氰胺抗體，加入酶標記物后，用底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物三聚氰胺的含量成負相關，與標準曲線比較可得出相應三聚氰胺的含量。
二、試劑盒檢測限
試劑盒檢測限： 10 ng/mL
三、 試劑盒組成
1．預包被板：96T
2．標準品液：（1mL/瓶） 0 ng/mL、20 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL
3．酶標記物 12 mL
4．抗體工作液 7 mL
5．底物緩衝液 7 mL
6．底物液 7 mL
7．終止液 7 mL
8．20倍濃縮洗滌液 50 mL
四、樣本處理
配製樣品稀釋液：
稱取89.5 g Na2HPO4·12H2O ，蒸餾水定容至1000 mL。
濕的寵物食品萃取方法（稀釋100倍）
1．勻質樣品到布丁狀；
2．稱取2 g樣品加入10 mL 60%甲醇水溶液，並劇烈振盪；
3．超聲萃取1 min，漩渦混合1 min，然後靜止5 min，使樣品分層；
4．5000 r/min室溫離心5 min，用玻璃纖維濾紙過濾上清液，並將其收集於乾淨試管中；
5．用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋；
6．取50 μL進行實驗。
干的寵物食品萃取方法（稀釋200倍）
1．均質干的寵物飼料樣品；
2．稱取1 g樣品加入10 mL 60%甲醇水溶液，並劇烈振盪；
3．超聲萃取1 min，漩渦混合1 min，然後靜止5 min，使樣品分層；
4．5000 r/min室溫離心5 min，用玻璃纖維濾紙過濾上清液，並將萃取液收集於乾淨試管中；
6．用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋；
7．取50 μL進行實驗。
液態奶/乳飲料（稀釋5倍）
1． 準確吸取1 mL液態奶或乳飲料于乾淨離心管中，冷藏至4℃備用；
2． 將1 mL液態奶或乳飲料樣品置於離心機中，5000 g離心10 min（建議10℃低溫離心），分離樣品中脂肪；
3． 棄上層脂肪，取0.2 mL離心后的脫脂液態奶或乳飲料試樣于乾淨試管中；
4． 加入0.8 mL樣品稀釋液于離心后的脫脂液態奶或乳飲料中，振盪混勻樣品，取50 μL進行實驗。
奶粉（稀釋25倍）
1． 稱取1 g奶粉樣品于乾淨試管中；
2． 加入5 mL的45～50℃溫水溶解奶粉並混勻后冷藏至4℃備用；
3． 取1 mL溶解好的奶粉試樣于離心管中，5000 g離心10 min（建議10℃低溫離心），棄上層脂肪，取0.2 mL試樣于乾淨試管中；
4．加入0.8 mL樣品稀釋液于試管中，振盪混勻取50 μL進行實驗。
酸奶：（稀釋5倍）
1． 準確吸取1 mL液態奶或乳飲料于乾淨離心管中，將PH值調至6～8，冷藏至4℃備用；
2． 將1 mL樣品置於離心機中，5000 g離心10 min（建議10℃低溫離心），棄上層脂肪，取0.2 mL試樣于乾淨試管中；
3． 加入0.8 mL樣品稀釋液于試管中，振盪混勻取50 μL進行實驗。
初乳樣品：（稀釋1倍）
直接法：將樣品4℃冷藏30 min后，4000 r/min離心15 min，棄去上層脂肪，取50 μL進行實驗。
五、操作步驟
1．將試劑盒從冷藏環境中取出，置於室溫（20～26℃）下平衡30min以上，將需用的板條放入支架，按順序編號；
2．洗液配製：將50 mL濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水稀釋至1000 mL備用（或按需量稀釋）；
3．在標準品孔中加入50 μL標準品，樣品孔加入50 μL待測樣品，然後每孔加入50 μL抗體（加入標品和樣品時無時間差的影響），輕拍混勻，37℃下孵育40 min；
4．倒出孔中的液體，用洗板機洗滌4～6遍；沒有洗板機的用戶可用300 μL洗液充入各孔中，靜置20 s，倒出孔中的液體，將微孔架倒置，在吸水紙上連續拍打3次以上，以保証完全除去孔中的液體，重複操作4～6遍；
5．加入酶標記物100 μL，輕輕振盪混勻，用蓋板膜蓋板後置37℃ 環境中反應20 min，取出重複洗板步驟；
6．顯色：每孔加入底物緩衝液50 μL，再加底物液50 μL，輕輕振盪混勻，用蓋板膜蓋板后，置37℃ 環境中反應10 min；
7．測定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振盪混勻．設定酶標儀于450 nm處，測定每孔OD 值，根據標準曲線計算樣品濃度。
六、 結果判定
以標準品百分吸光率為縱坐標，以三聚氰胺標準品濃度（ng/mL）的半對數為橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中三聚氰胺實際濃度。
七、 注意事項
1．試劑及樣本沒有回到室溫（20～26℃）會導致所有標準的OD值偏低；
2．洗板拍干后應立即進行下一步操作；
3．混合要均勻，洗板要徹底，否則會出現重複性不好的現象；
4．反應終止液為2 mol/L硫酸，避免接觸皮膚。
5．將不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下；
6．不要使用過了有效日期的試劑盒，不要使用不同批號試劑盒中的試劑；
7．顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之，0濃度標準品的吸光度值小於0.6時，表示試劑可能變質；
8．該試劑盒最佳反應溫度為37 ℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
八、儲藏條件和保質期
儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。
保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。
