一、原理
本試劑盒採用固相酶聯免疫吸附ELISA原理，通過黃曲霉毒素B1(AFB1)抗原和曲霉毒素B1(AFB1)抗體，待測抗原的競爭免疫反應，以及酶的催化顯色反應來檢測AFB1，優點是靈敏度高，特異性好，操作簡便，結果易判讀，適用於食品、飼料及相關原料中AFB1的定量檢測。
二、試劑盒技術指標
試劑盒靈敏度：0.1 ppb
回收率： 穀物/飼料中AFB1回收率 95%±15%
變異係數：批內變異係數<10%，批間變異係數<15%。
三、試 劑 盒 組 成
1．微量測試孔： 96T/8孔
2．標 准 液×6瓶：（1 mL/瓶） 0 ppb 0.05 ppb 0.15 ppb 0.45 ppb 1.35 ppb 4.05 ppb
3．抗體工作液 7 mL
3．酶標記物 12 mL
4．底物緩衝液 7 mL
5．底物液 7 mL
6．終止液 7 mL
7．20倍濃縮洗滌液 50 mL 加蒸餾水后稀釋到1000 mL。
四、樣本前處理步驟
實驗準備：配製60 %甲醇水溶液（v/v，60：40）和20 %甲醇水溶液（v/v，20：80）。
注意：請精確配製上述溶液，以免影響檢測的準確性。
1 . 脂肪含量低的固體樣品（如大米、玉米、小麥和飼料等）
1、稱取5 g 粉碎樣品于100 mL帶塞三角瓶內，準確加入25 mL 60%甲醇水溶液。
2、將加入了甲醇水溶液的樣品放入振盪器內（或用手強力振盪），充分振盪3 min后，用濾紙過濾，收集濾液。
3、取濾液2 mL，加入6 mL 20 %甲醇水溶液，混勻，用whatman 1號濾紙過濾，此為樣品待檢液。
2．醬油、醋
1、稱取5 g樣品于25 mL小燒杯中，用10 mL蒸餾水將試樣轉移到125 mL分液漏斗中，加入25 mL三氯甲烷，加塞輕輕振搖3 min，靜置分層。
2、放出下層三氯甲烷層，取5 mL于20 mL蒸發皿中，65 ℃水浴通風揮干。揮干冷卻后，準確加入5 mL 60%甲醇水溶液，將蒸發皿中的凝結物充分溶解。
3、取溶解液2 mL，加入6 mL 20%甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。
3．食用油（如菜油、麻油、色拉油、花生油等）
1、稱5 g油樣于25 mL小燒杯中，用20 mL石油醚或正乙烷分次將試樣轉移至125 mL分液漏斗中，準確加入25 mL 60%甲醇水溶液溶液，加塞輕輕振搖5 min，靜置分層，放出下層60%甲醇水提取液。
2、取提取液2 mL，再加入6 mL 20%甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。
4．酒類
1、稱取5 g樣品于125 mL分液漏斗中，加入25 mL三氯甲烷，加塞輕輕振搖3 min，靜置分層。
2、放出下層三氯甲烷層，取5 mL于20 mL蒸發皿中，65 ℃水浴通風揮干。揮干冷卻后，準確加入5 mL 60%甲醇水溶液，將蒸發皿中的凝結物充分溶解。
3、取溶解液2 mL，再加入6 mL 20%甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。
5．花生
1、樣品去殼粉碎，稱取5 g于100 mL具塞三角瓶中。加入25 mL 60%甲醇水溶液和20 mL正乙烷（或石油醚），振搖10 min，用whatman 1號濾紙過濾。
2、收集濾液于125 mL分液漏斗中，靜置分層后放出下層60%甲醇水提取液。
3、取提取液2 mL，再加入6 mL 20%甲醇水溶液，混勻，再用whatman 1號濾紙過濾，此為樣品待檢液。
6．月餅、桃酥、花生醬等
1、稱取5 g粉碎樣品于125 mL具塞三角瓶中，準確加入25 mL 60%甲醇水溶液和20 mL正乙烷（或石油醚）加塞震盪10 min，過濾，收集濾液于分液漏斗中，靜置分層。
2、待下層甲醇水溶液澄清后，放出甲醇水溶液于另一三角瓶中。吸取10 mL甲醇水提取液于125 mL分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，加塞輕輕振搖3 min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，取10 mL于20 mL蒸發皿中，65 ℃水浴通風揮干。揮干冷卻后，準確加入5 mL 60%甲醇水溶液，將蒸發皿中的凝結物充分溶解。
3、取溶解液2 mL，再加入6 mL 20%甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。
7．麵粉、飼料濃縮料
1、稱取5 g樣品于125 mL具塞三角瓶中，準確加入25 mL 60%甲醇水溶液加塞震盪10 min，過濾，收集濾液。
2、吸取10 mL濾液于125 mL分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，加塞振搖3 min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，取10 mL于20 mL蒸發皿中，65 ℃水浴通風揮干。揮干冷卻后，準確加入5 mL 60%甲醇水溶液，將蒸發皿中的凝結物充分溶解。
3、取溶解液2 mL，再加入6 mL 20%甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。
注意：
1、某些樣品待檢液(如花生等)久置會影響檢測結果的準確性，為保証檢測的準確性，樣品提取后請即時檢測。
2、 若樣品待檢液不立即檢測，請將其存儲于棕色玻璃瓶內，2-8 ℃避光保存。
3、 試劑盒在使用前，請將試劑盒內所有試劑放到室內溫度（20-25 ℃）進行溫度平衡；試劑用完后立即將其放置回2-8 ℃冰箱內保存。
4、 在每個步驟操作時，速度要快，不要將板孔暴露在空氣中時間過久，避免酶標板變干。未用完的酶標板需密閉于自封帶內，防止受潮且避光保存於2-8 ℃冰箱內。
5、 溫育時，需避光，建議將酶標板置於濕盒內(在有蓋容器內放置一塊平整濕紗布)進行溫育。
五、操作步驟：
1．將試劑盒從冷藏環境中取出並將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25 ℃）平衡30 min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2．按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存於2-8 ℃，不要冷凍。
3．加標準品/樣本50 µL /孔，然後加抗體工作液50 µL /孔，輕輕振盪混勻，用蓋板膜蓋板，室溫下環境反應40 min。
4．洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。
5． 加入100 µL酶標記物應用液到微孔板中，輕輕振盪混勻，用蓋板膜蓋板后，室溫下反應20分鐘。
6．棄去孔中的液體，並在吸水紙上拍干，每孔注滿稀釋好的濃縮稀釋液，輕輕振盪，棄去孔中液體，並在吸水紙上拍干，重複4次。
7．顯色：每孔加入底物緩衝液50 µL，再加底物液50 µL，輕輕振盪混勻，室溫環境下避光顯色10 min。
8．測定：每孔加入終止液50 µL，輕輕振盪勻，設定酶標儀于450 nm處（在20 min內讀完數據），測定吸光度值。
六、結果判定
以標準品百分吸光率為縱坐標，以黃曲霉毒素B1(AFB1)標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中黃曲霉毒素B1(AFB1)的實際濃度。
七、注意事項
1．室溫低於20 ℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25 ℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2．洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3．混合要均勻，洗板要徹底，否則會出現重複性不好的現象。
4．反應終止液為2 M硫酸，避免接觸皮膚。
5．將不用的微孔板放進自封袋重新密封; 標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
6．不要使用過了有效日期的試劑盒，不要使用不同批號試劑盒中的試劑。
7．顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之，0標準的吸光度值小於0.5時，表示試劑可能變質。
八、儲藏條件和保質期
儲藏條件：試劑盒于2-8 ℃ 保存，不要冷凍。
保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。
