一、 原理
本試劑盒採用間接競爭ELISA方法檢測水產和雞肉等組織樣本中的己烯雌酚，在微孔條上預包被上偶聯抗原，利用抗原與抗體的特異性免疫化學反應的原理來進行的，樣本中的己烯雌酚和微孔條上預包被偶聯抗原競爭抗己烯雌酚的抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣品中的己烯雌酚含量與樣品的吸光度值呈反比，與標準曲線比較即可得出己烯雌酚含量。
二、 試劑盒技術指標：
試劑盒靈敏度： 0.1ppb
樣本檢測下限：
組織（蝦、魚） 0.1ppb
豬肉/肝 雞肉/肝 2ppb
飼料 20ppb
尿液 0.6ppb
回收率：
飼料 90±10%
組織 85±10%
尿液 80±10%
交叉反應率：
己烯雌酚 100%
雙烯雌酚 35%
己烷雌酚 10%
己炔雌二醇 <0.1%
雌三醇 <0.1%
三、試劑盒組成
1．酶標板：96T/8孔
2．標準品液： 0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb（1.0mL/瓶）
3．酶標記物 12mL
4．抗體工作液 7mL
5．底物緩衝液 7 mL
6．底物液 7 mL
7．終止液 7 mL
8．20倍濃縮洗滌液 50 mL 用去離子水稀釋到1000 mL
9．20倍濃縮復溶液 12mL 用去離子水稀釋到240 mL
四、樣本前處理步驟
樣本處理前須知：
1．實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
2．實驗之前須檢查各種實驗器具是否乾淨，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。
樣本前處理需配製：
配液1：6M H3PO4 100mL 濃H3PO4（含量85%） 加去離子水150mL混合均勻
配液2：1M NaOH 4g NaOH 加去離子水100mL溶解
配液3：2M NaOH 8g NaOH 加去離子水100mL溶解
配液4：乙腈-丙酮 80mL 乙腈 加入丙酮20mL混合均勻
樣本的處理：
（a）飼料樣本
1．稱取2±0.05g搗粹后的飼料樣本，加入8mL乙腈，振搖10min，15℃，3000g以上，離心10min；
2．取2mL上清液，60℃氮氣/空氣吹干；
3．加入0.5mL氯仿，渦動20s，加入2mL 1M NaOH，渦動30s，3000g以上，離心5min；
4．取1mL上清液，加入100µL 6M H3PO4，渦動5s；
不同樣本按如下方法稀釋：
配合料：取50µL，加入950µL的復溶液，渦動混勻，取50µL /孔用於檢測。
濃縮料/預混料：取25µL，加入975µL復溶液，渦動混勻，取50µL /孔用於檢測。取50µL用於分析。
配合料稀釋倍數：100
濃縮料、預混料稀釋倍數：200
（b）組織（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚）
1．稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入6mL乙腈-丙酮，振搖10min，15℃，3000g以上，離心10min。
2．取3mL上清液，60℃氮氣/空氣吹干。
加入0.5mL氯仿，渦動20s，加入2mL 2M NaOH，渦動30s，3000g以上，離心5min。
3．取1mL上清液，加入200µL 6M H3PO4，渦動5s。
4．加入3mL乙腈萃取，振盪10min，室溫3000g以上，離心10min，取上層有機相， 60℃氮氣/空氣吹干。
用1mL復溶液溶解乾燥的殘留物。
不同樣本按如下方法稀釋：
蝦魚：直接取50µL水相用於檢測。稀釋倍數：2
豬肉/肝、雞肉/肝：取50µL水相加入450µL稀釋后的復溶液，渦動均勻；取50µL用於檢測。
稀釋倍數：20
（c）尿液
1．取2mL尿液到離心管中，室溫3000g以上，離心10min，直至清亮；
2．移取1mL清亮尿液至離心管中，加入1mL 1M NaOH強烈振盪5min；
3．加入100µL 6M H3PO4，渦動30 s；
4．再加入8mL氯仿進行萃取，振盪10min。15℃，3000g以上，離心10min；
5．去掉上層的水相，取下層有機相4 mL，60℃氮氣/空氣吹干；
6．用3mL稀釋后的復溶液乾燥的殘留物；
取50µL 用於分析。
樣本稀釋倍數：6
五、操作步驟
1． 將試劑盒從冷藏環境中取出並將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2． 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存於2-8℃，不要冷凍。
3． 加標準品/樣本50µL /孔，然後加入抗體工作液50µL /孔，再振盪混勻，用封板膜蓋板，室溫反應30min。
4． 洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。
5． 加入酶標記物100µL /孔，用封板膜蓋板，室溫反應20min。
6． 洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。
7． 顯色：每孔加入底物緩衝液50µL，再加底物液50µL，輕輕振盪混勻，25℃環境避光顯色10min。
8．測定：每孔加入終止液50µL，輕輕振盪勻，設定酶標儀于450nm處（在20min內讀完數據），測定吸光度值。
六、結果判定
以標準品百分吸光率為縱坐標，以己烯雌酚標準品濃度（ng/mL）的半對數為橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中己烯雌酚實際濃度。
七、注意事項
1. 終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
2. 不要使用已過有效日期的孔雀石綠檢測試劑盒；不同批次、不同試劑盒之間的試劑等內容不可混用，以免降低靈敏度。
3. 0標準液的A450nm<0.6時，表示試劑可能變質，請勿使用。
4. 顯色劑變藍，表明已變質，請勿使用。
八、儲藏條件和保質期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。
